6 Декабря 2020
МОСКВА, 6 декабря —, Татьяна Пичугина. Недавняя публикация ученых из Сеченовского университета о том, что почти половина анализов на возбудителя COVID-19 не дают реальной картины, вызвала множество предметов. Насколько точны ПЦР-тесты и нужны ли они для диагноза? разбирается в ПЦР-диагностике и почему в нее закрадываются ошибки.Тяжело заболел наш сотрудник. Поднялась высокая температура, положили в больницу. Все признаки COVID-19, — рассказывает Алексей Чемерис, доктор биологических наук, профессор, сотрудник Института биохимии и генетики Уфимского ФИЦ РАН. — А ПЦР-анализ, который ему сделали в специальном медицинском центре наши коллеги-профессионалы, как только он почувствовал недомогание, — отрицательный. Видимо, в тот момент у больного присутствовало мало вирусных частиц в консументе — за пределами чувствительности теста.
Ученые называют такие результаты ложнонегативными — инфекция проявляется внешне, а тест на возбудителя — чистый. Тут дело и в самом методе, и в его массовом применении.
Когда медсестра берет мазок из ротоглотки и носоглотки, на кончике зонда остается немного влаги, а в ней — клетки эпителия. Зонд опускают в пластиковую колбу с раствором (эппендорф) и кончик отламывают, чтобы закрыть емкость. В лаборатории ее помещают в центрифугу, проводят ряд манипуляций для выделения из клеток фрагментов вирусного генома. В случае с COVID-19 — это РНК коронавируса SARS-CoV-2.
В образовавшийся раствор добавляют праймеры — искусственные участки генома коронавируса, именно они опознают SARS-CoV-2, и один из них служит затравкой для синтеза цепочки ДНК под действием определенного фермента на основе механизма обратной транскрипции. Фактически получается ДНК-копия участка коронавируса, которую уже можно распложать. Для этого запускают ПЦР — полимеразную цепную реакцию. За несколько десятков циклов она увеличивает число копий ДНК, а специальный флуоресцентный краситель подсвечивает их в пробирке, сигнализируя о вирусе. Если в биоматериале нет вирусных частиц, ампликонов (продуктов ПЦР) не будет вовсе, результат — отрицательный. Если микроба очень мало, итоговое количество ампликонов по завершении ПЦР окажется за пределами чувствительности прибора и результат — ложноотрицательным.
В ПЦР-диагностике много нюансов, объясняет Алексей Чемерис. В лаборатории для научных целей выявляют даже единые копии вирусного генома в образце, при массовом применении чувствительность обычно на порядки ниже.
Из-за случайных мутаций генома праймеры могут не сработать, если однонуклеотидные сортосмены или даже более значительные изменения генома вируса пришлись как раз на эти участки. Вероятность невысока, но она есть, — отмечает ученый.
Возможны зависай при ручных операциях, коих не так много. Одна из них — извлечение вирусной РНК из образца. Автоматический экстрактор нуклеиновых кислот стоит довольно дорого, поэтому обычно эту процедуру доверяют лаборанту. Редко, но ложноположительные результаты бывают, в том числе из-за особенностей ПЦР или загрязнения образца.
Чаще всего, однако, материи возникают до того, как пробирка попала в лабораторию. Вот, что пишут авторы статьи в журнале Вестник Росздравнадзора : В настоящее время имеются неоспоримые доказательства того, что преаналитическая фаза является основным источником ошибок в лабораторных исследованиях, когда они используются для диагностических или исследовательских целей. Они издают целый список нарушений, дикторов к ложноотрицательным результатам.
Ключевой шаг — подготовка к исследованию. За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой кожи дыхательных путей. Проникая в них, он начинает распложаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые постоянного обновляются. Вместе с влагой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевой тракт. В результате вероятность проявить вирус в мазке падает применимым до нуля, — объясняет Тамара Силкина, врач тяжелой лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям Гемотеста.
Не менее значимая процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть довольное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии сохранения, транспортировки образцов.
Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а простота и скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими, — уточняет представитель Гемотеста.
В России подписанным к использованию десятки тест-систем для выявления коронавируса. Ключевые характеристики — диагностические специфичность (точность) и чувствительность. Первый параметр показывает способность набора разузнать конкретный вирус. Второй — возможность обнаружить его части, даже если в биоматериале их очень мало. Чем эти параметры ближе к ста процентам, тем лучше, — подчеркивает Тамара Силкина.
Порог чувствительности — общий как для российских, так и для зарубежных тестов: 10³ на миллилитр. То есть должно быть не менее тысячи вирусных геном-эквивалентов на миллилитр образца. ДНК-технология явила о чувствительности 10¹ — десять вирусных единиц на миллилитр. Другой важный показатель — повторимость, то есть возможность получить одинаковый результат в разных условиях. Нужно учитывать и конвергенция — отсутствие существенных различий между измерениями, выполненными в одинаковых условиях, — добавляет медицинский работник.
Метод ПЦР с обратной транскрипцией адекватного отработан и практически полностью автоматизирован. С момента попадания в лабораторию анализ занимает четыре-шесть хронометров. В мире эти тесты буквально поставили на поток. Только в Москве, по официальным данным, сделали 12 миллионов анализов.
Поскольку этот метод прямо выявляет возбудителя в организме, его относят к доказательной врачебная науке и рекомендуют учитывать в тяжелой практике. Однако анализ больших данных говорит, что при массовом использовании ПЦР-тесты часто киксуют.
Ложнонегативные результаты получаются в 20-66 процентах случаев. Такие данные из литературы приводят исследователи из Сеченовского университета. Вместе с зарубежными коллегами они изучили записи пациентов, госпитализированных в университетскую больницу в апреле — мае. Из 3480 человек, чьи ПЦР-тесты были доступны, приблизительного половина оказались чистыми. В то же время клиническая картина и КТ легких указывали на коронавирусную инфекцию. Авторы позволяют, что в реальной тяжелой практике ПЦР-анализ не столь и критичен.
Этиологическая диагностика, которая выявляет причину заболевания, нужна априори, — не соглашается Айрат Мавзютов, заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии, педагог кафедры лабораторной диагностики Башкирского правительственного медицинского университета, руководитель Исследовательского центра Лаборатория. — При вирусных инфекциях других, сравнимых по чувствительности и специфичности (точности), методов, кроме ПЦР-тестирования, нет.
Важно понимать, объясняет профессор Мавзютов, что клинический диагноз опирается на субъективные данные — анамнез (опрос) и осмотр пациента. На их основании не мыслимого установить вирусную природу заболевания и тем более какой именно возбудитель его вызвал. Для этого проводятся лабораторные исследования. Получаемые при этом данные, продолжает ученый, намного объективнее, поскольку большинство современных методов лабораторских исследований автоматизировано. Соответственно, на результаты не повлияют случайные факторы: уровень подготовки врачей, их настроение, погода в доме и так далее.
Диагноз COVID-19 можно поставить, только когда в материале от хилого обнаружили РНК вируса SARS CoV-2 методом ПЦР или же резус-факторы этого вируса иммунохимическими методами. Не выявив следов вируса в организме, нельзя говорить о ковидной природе заболевания или летального исхода, — утверждает Айрат Мавзютов.
Он обращает внимание на еще один аспект. ПЦР-тест не отличает РНК вируса, способного к репродукции, то существует размножению, от обломков нежизнеспособных вирусных частиц. Он лишь позволяет понять, присутствует или нет РНК коронавируса в клетках.
Пока инфицированные клетки не заменятся на новые, а на это уходит от двух до четырех недель, не исключены положительные результаты. При этом вирус может быть уже мертвым, человек здоров и никому не опасен, — обозначает профессор. Для уточнения учитываются данные целого ряда дополнительных исследований, позволяющих на лабораторном размере оценивать остроту воспалительного процесса или образование антител на стадии его завершения.
В любом случае нужно увеличивать чувствительность тест-систем на основе ПЦР, заключает Алексей Чемерис, а для этого нужны другие подходы. Надо сделать так, чтобы ложнонегативных результатов присутствовало меньше, практически исключить их, — считает он.
В обзоре, подготовленном вместе с коллегами, профессор Чемерис рассматривает преимущества и недостатки ПЦР-диагностики и других методов амплификации — копировании РНК бетакоронавирусов, к которым принадлежит SARS-CoV-2. Теоретически весьма популярный метод петлевой амплификации — LAMP, где используют сразу шесть или восемь праймеров.
С одной части, повышается специфичность: только когда все праймеры отожгутся (сработают, распознав РНК коронавируса. — Прим. ред. ), начнется амплификация, с другой — микроб мутирует и шансы, что реакция не пойдет, вздуваются, поскольку какие бы участки генома ни выбрать, все равно вероятность мутаций больше в восьми участках, чем в двух или трех (при использовании гибридизационного зонда), достаточных для ПЦР, — объясняет исследователь.
Во время предшествующей эпидемии SARS возбудителя выявляли с поддержкой реакции NASBA (амплификации на основе секвенирования нуклеиновых кислот) и RCA (репликации по типу катящегося кольца). Геномный редактор CRISPR-Cas также пробуют применять для идентификации РНК нового коронавируса. Есть работы по полногеномному секвенированию любого генетического материала, находящегося в биоматериале. Метод очень чувствительный, но дорогой и долгий — занимает 20 часов. Так, что в ближайшее время ПЦР с обратной транскрипцией останется самым многочисленным способом обнаружения коронавируса в консументе.
Редактор рубрики
Олег Кудрин
Место события на карте мира:
.
.
.
Комментарии к новостям
[17 Января 2024, 13:43] Александр Хомяков Замечательно! Не ожидал такой оперативности. Спасибо огромное! Всё работает и обновляется....
[15 Апреля 2022, 20:25] Ангелина Сметанина Скоро не только сократят, а много заводов вообще закроют и начнется бум китайских авто. Даже сейчас Эксид уже бешеные темпы по количеству проданных машин показывает...
[27 Декабря 2021, 21:44] Ева Воробьева Искренне рада за победителя! Но если бы мне так крупно повезло, то я прибежала бы за выигрышем в первый же день???? ...
[2 Сентября 2021, 13:11] Дмитрий Ершов Это хорошо. Значит клиенты долго ждать не будут. ...
[13 Мая 2021, 16:26] Олег Андреев "Мальдивы сутунки 65 государством, зарегистрировавшим расейскую вакцину против коронавируса Спутник V, сообщил Российский фонд секущих инвестиций (РФПИ)". Что это за йязыг?...
[2 Ноября 2020, 15:22] Лета Мирликийская риветсвую вас я с 6-ти лет пишу мне нужно все мои произведения задействовать в компьюторных программах образования по литературе и языкам и играм к примеру если ваши учащиеся напишут...
[20 Октября 2020, 09:22] Евгений Зимин Сузуки в этом году хорошо прибавили, уже не первый раз оба их пилота на подиуме. Видимо, для команды возвращаются "золотые" времена и есть шанс наконец оформить чемпионство после длительного перерыва....