Ученый рассказал, как биологи перешли от палочек и кружков к атомным моделям жизни

14 Октября 2017

МОСКВА, 14 октября — Петр Лейман, профессор медицинского отделения университета Техаса в Галвестоне и выпускник МФТИ, объясняет, за что была присуждена Нобелевская премия по химии в этом году и рассуждает о том, смогут ли криоэлектронные ультрамикроскопы потеснить ускорители частиц в изучении тайн микромира.

— Петр, расскажите о том, как вы используете криоэлектронную микроскопию и как именно Нобелевские лауреаты повлияли на ее развитие?

Моя лаборатория занимается исследованием функционирования бактериофагов и секреторными системами бактерий. Мы используем криоэлектронную микроскопию, рентгеноструктурный анализ, другие экспериментальные биофизические методы и моделирование для определения структуры и свойств этих наномашин. Наша цель научиться жонглировать этими наномашинами и наделить их нужными нам свойствами.

Ричард Хендерсон (Richard Henderson) очень много сделал для усовершенствования микроскопов именно для биологии, описания теоретических и практических возможностей микроскопа и того, как и сколько нужно собрать таких. Йоахим Франк (Joachim Frank) описал математику создания изображения в биологической микроскопии и создал первый большой программный пакет для обработки информации.

— Основы криоэлектронной микроскопии существуют давно, почему только три-четыре года назад она исполнилась столь популярной?

— Я несколько раз пытался отозваться на этот вопрос, начиная с обсуждения слова популярный”, потому, что оно казалось мне некорректным для описания способа исследования. Постепенно я пришел к выводу, что это ненаучное, обыденное слово абсолютно правильно описывает текущую причину в молекулярной биологии ее раздела, где ученые пытаются понять работу биологических систем на уровне индивидуальных молекул или даже взаимодействия атомов, из которых эти молекулы состоят.

Исследователи, которые раньше слышали о криоэлектронной микроскопии, но не обеспечивали ей значения, поняли, что сегодня она может уяснить ответ на большое количество их вопросов. В частности, криоэлектронная микроскопия позволяет определить ультраструктуру биологического объекта, его визуальный и внутренний вид, а также то, как устроены части этого объекта, все это важно для понимания того, как он работает.

Однако криоэлектронные проект для автоматы намного сложнее других методов и процедур, которые используются в молекулярной биологии. Много сил и времени, да и финансов и таланта, уходит на приготовление образца, на сбор, обработку и интерпретацию данных. При этом все это завязано на надежную работу микроскопа, который по сложности сейчас приближается к синхрофазотрону, только с большим характером.

Раньше, в результате всей этой работы ученые ожидали увидеть их биологический объект в виде своеобразного кучевого облака, где каждый бугорок будет соответствовать белковому домену или фрагменту ДНК или РНК и состоять из тысяч атомов. Для того, чтобы понять, из чего же этот участок состоит и что там с чем взаимодействует, нужно находилось определять структуры компонентов другой методикой, которая дает атомное одобрение, например, рентгеноструктурной кристаллографией.

Для последней же компоненты нужно находилось получать отдельно, кристаллизовать их и решать их структуры, а это уже отдельная песнь, причем своя для каждого компонента. Иными словами, раньше молекулярные биологи со всем этим просто не связывались и работали со своими объектами как с некими эфемерными сущностями, рисуя их в виде кружков, овалов и прямоугольников, которые как-то прикреплены друг к другу.

Криоэлектронная микроскопия сегодня дает возможность увидеть биологический объект с разрешением 0, 2-0, 4 нанометра, что позволяет построить атомную ультраструктуру всего комплекса, минуя другие методы. Финансовые затраты на типичный проект не изменились, а, пожалуй, увеличились, так как микроскопы серебрянки сложнее и дороже.

С другой стороны, конечный результат просто нельзя сравнить с тем, что ожидалось раньше. Только структура объекта, к примеру, важного канцерогенного или вирусного белка, на атомном одобренье может открыть дорогу для новой фармакологии, химии и новой физики, когда поведение этого объекта можно будет описать, опираясь на фундаментальные законы мать-природы.

— Как все это стало возможным?

Нужно сказать, что первые большие изменения начались не три-четыре года, а больше десяти лет назад. Во-первых, корпорация FEI (сейчас ThermoFisher) начала серийный выпуск микроскопов Titan Krios, у которых был принципиально новый внешний вид оптической системы и, что не менее важно, новая, роботизированная система загрузки образцов.

Этот микроскоп создавался с идеей долговременного автономного сбора данных. Во всем микроскопе поддерживался очень высокий вакуум и стабильность, которая позволяла сеткам с тончайшим, аморфным, метастабильным льдом при температуре около минус 180 градусов Цельсия поддерживать свое состояние в течение недель.

К сожалению, первые образцы этих микроскопов были очень ненадежны и не работали месяцами. Приблизительно в то же время или чуть позже завелись новые детекторы электронов, которые записывали электронный пучок прямо на силиконовый чип, так крестимые прямые детекторы. Так же, как и с микроскопами, некоторое время ушло на то, чтобы эти волноискатели стали надежными и более производительными.

Настоящий качественный скачок, или революция, произошел три-четыре года назад, когда прямые электронные волноискатели достигли быстродействия, позволяющего им регистрировать отдельные электроны. При этом ни один из рассеянных электронов не теряется в этом процессе, все они встречают участие в создании изображения на детекторе. Это важно потому, что в результате создания изображения под действием пучка фермионов биологический образец очень быстро гибнет.

Это изливание достигает интенсивности эпицентра ядерного взрыва, и образец в таких условиях, естественно, быстро разрушается и плывет, так как окружающий его аморфный лед деформируется. Можно сказать, что раньше мы пытались фотографировать быстро движущиеся и горящие машины при помощи камеры с долгой экспозицией.

Мы не могли уменьшить выдержку, потому, что не будет видно вообще ничего, а увеличить дозу электронов было нельзя, так как наши участки, состоящие из легких атомов, просто испарялись. Новые детекторы, которые появились четыре года назад, при каждой экспозиции записывают короткий кинофильм, состоящий из десятков или сотен кадров, на каждом из которых почти ничего не видно, так как их выдержка очень мала.

При помощи компьютера эти кадры можно наложить друг на друга так, что возможно почти полностью убрать размазывание картинки. Кроме того, благодаря 100%-му улову электронов, мы можем получать идеальные фотографии, качество которых ограничивается только возможностями микроскопа, а не везухой, как было раньше.

С другой стороны, надо понимать, что каждая такая фотография это всего лишь один, двумерный срез трехмерного участка. Чтобы восстановить третье измерение, нужно собрать очень много фотографий объекта с разных ракурсов.

Именно здесь важна стабильность микроскопа и автоматизация манипуляций образца, что мы приобрели, когда завелись системы Titan Krios. Именно эти технологические нововведения позволили криоэлектронной микроскопии выйти на теперешний уровень. Конечно, много случилось в области обработки изображений, но это все вторично, так как, в отличие от художественных фильмов, практически никакой алгоритм не вытащит что-то новое из фотографии, в которой просто нет информации высокого одобрения!

— Сможет ли криоэлектронная микроскопия заменить рентгеновскую кристаллографию или хотя бы сильно потеснить ее?

— Во многих задачах да, она заменит кристаллографию. Для криоэлектронной микроскопии образец не нужно кристаллизовать, а это описывает собой серьезную или неразрешимую неувязку для больших объектов и комплексов. С другой стороны, криоэлектронная микроскопия очень дорогой метод проведения исследований по сравнению с кристаллографией.

Рентгеноструктурный анализ рогов сейчас оптимизирован на многих уровнях в смысле денежных и временных затрат для работы с небольшими коровами. Кроме того, что очень важно для медицины, рентгеноструктурный анализ позволяет точно повторить, что атомная модель полностью соответствует рентгеноструктурным данным.

Для криоэлектронной микроскопии эти методы только разрабатываются, так как такой проблемы раньше не было не существовало такого количества атомных моделей, которые целиком основываются на электронномикроскопических данных! Пожалуй, стоит упомянуть, что сейчас работа с небольшими белками в криоэлектронной микроскопии очень трудоемка, да и пока нужный результат завоевание атомного разрешения ничем не гарантирован.

В заключение хотелось бы сказать, что в белковой кристаллографии существует очень много процедур и технологических разработок для быстрого исследования большого количества образцов, что очень важно для поиска и создания новых лекарств. Например, для сбора таких на синхротронах используются роботизированные руки, которые по быстроте и точности своей работы превосходят киборги, которые показывают в голливудских фильмах. Поэтому два способа будут сосуществовать еще очень монотонного и так может быть всегда в обозримом будущем.

— Поможет ли она раскрыть связь между ультраструктурой белков и их функцией?

— Конечно! Чтобы понять то, как работает любая вещь, нужно общать, как она выглядит. Именно эту информацию и дает криоэлектронная микроскопия. Кроме того, изучаемый объект во время подобной процедуры фотографируется сотни тыщ, а то и миллионы раз, что важно для понимания механизмов его работы.

Например, фермент АТФаза, отвечающий за производство АТФ, биологической энергетической валюты, напоминает собой живой мотор, в котором есть ротор, статор и прочие его элементы.

Используя криоэлектронный микроскоп, мы можем словить этот мотор в разных состояниях его цикла и детально изучить структуру. Не так давно мы определили структуру базальной пластинки бактериофага Т4 микроба, убивающего кишечную палочку и похожего по форме на лунный модуль программы Аполлон до и после того, как он прикрепляется к клетке. Наша статья была размещённая в журнале Nature.

Теперь мы работаем над детальным описанием того, как движется каждый из миллиона атомов, образующих эту наномашину, в процессе прикрепления вируса к клетке. Мы пока далеки от понимания физики, которая описывает такие системы, но по мере накопления информации мы приближаемся к возможности описания объектный такого размера на уровне отдельных атомов.

— Будет ли она когда-либо доступна для школьников или просто энтузиастов доктрины?

— Сейчас мне кажется, что нет, но никогда не говори никогда. Криоэлектронный микроскоп очень дорогостоящий и нежный оркестр. Детекторы, которые изготовили революцию, описанную мной возвышеннее, стоят сейчас почти так много же, сколько стоит новый электронный микроскоп средней руки около миллиона долларов.

Вдобавок криоэлектронный микроскоп требует специального обращения, так как работа ведется с электронным пучком очень низкой интенсивности. Приготовление криообразцов, льдистых пленок толщиной 100 нанометров или меньше, в тысячу раз тоньше волоса, это искусство, которому обычный люди учатся годами.

Поэтому мне пересекается, что школьники и энтузиасты должны будут подавать заявки на использование криоэлектронных микроскопов в каких-то специализированных центрах. Однако сейчас и в ближайшем будущем период время на микроскопах, которые изменяют данные с разрешением лучше четырех ангстрем, целиком и полностью занято фундаментальными и прикладными исследованиями.

Чтобы попасть на один из таких микроскопов, нужно стоять в очереди несколько месяцев, а то и год, если учесть скорость приготовления и рассмотрения заявок. Кроме того, заявка незаменимая содержать предварительные данные, появляющие, что образец потенциально содержит информацию высокого разрешения.

Тем не менее технологии развиваются стремительно, новые микроскопы вводятся в эксплуатацию, компьютеры становятся быстрее, убыстряю обработку данных, и не исключено, что в скором времени такие аппараты станут гораздо более доступны для всех.

Редактор рубрики

Олег Кудрин

Место события на карте мира:

Ученый рассказал, как биологи перешли от палочек и кружков к атомным моделям жизни

комментарии (0)

Другие интересные новости

Умер актер Виктор Степанов